如何做好RNA提取

RNA定義：

RNA作為重要的生物大分子，是生命現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)之一。mRNA在信息傳遞中起很重要的作用ea6d18。其它兩大類RNA，rRNA和tRNA，同樣在蛋白質(zhì)的生物合成中發(fā)揮不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遺傳信息由DNA傳遞到表現(xiàn)生命性狀的蛋白質(zhì)的過程中舉足輕重。很多實(shí)驗(yàn)中也需要提取相應(yīng)樣本的RNA作為實(shí)驗(yàn)原料。

提取方法：

   1.Trizol法異硫氰酸胍/苯酚法

TRIzol試劑有多組分分離作用，最大特點(diǎn)就是可同時(shí)分離一個(gè)樣品RNA/DNA/蛋白質(zhì)。TRIzol使樣品勻漿化，細(xì)胞裂解，溶解細(xì)胞內(nèi)含物，同時(shí)因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA，用乙醇沉淀中間層可回收DNA，用異丙醇沉淀有機(jī)相可回收蛋白質(zhì)。

   2.CTAB法

影響因素：

1.樣本材料：

●建議使用新鮮材料。切記使用反復(fù)凍融的材料。

●材料長期保存建議液氮，—80℃短期保存

2.樣本處理：

根據(jù)不同材料選擇不同的樣本處理

●培養(yǎng)細(xì)胞:通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀?/span>

●酵母和細(xì)菌:直接液氮研磨，之后用Trizol裂解

●動(dòng)植物組織:先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。

純化方案：

●經(jīng)典的沉淀方法，雖然經(jīng)濟(jì)，但操作時(shí)間長，易造成 RNA 降解;

●離心柱式純化方法:抽提速度快，能有效去除影響后續(xù)RNA酶反應(yīng)的雜質(zhì)。

●磁珠法：同時(shí)兼具了樣本需求低、操作方便、適配全自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，目前是尤為常用的核酸純化方法。

常見問題：

1.RNA降解

●樣品取樣以及保存是否得當(dāng)

●裂解液的質(zhì)量

●外源RNase的污染

●裂解液的用量不足

●組織裂解不充分

●另外某些富含內(nèi)源酶的樣品(如脾臟，胸腺等)，很難避免RNA 的降解。

2.OD260/OD280<1.65 

●檢測(cè)吸光度時(shí)，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低PH值條件下OD280值偏高； 

●樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少或樣本量過多； 

●吸取水相時(shí)混入了有機(jī)相； 

●RNA沉淀未*溶解。

3.RNA總量低

●樣本選擇問題：樣本自身豐度不足

●樣品裂解或勻漿處理不*；

●RNA沉淀未*溶解。

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